检测微生物检测方法和操作步骤

产品采集与样品处理

于同一批 号的 二个运输包装中至少抽取 12个蕞小销售包装样品，1/4样品用于检测，1/4样品用于留样，另 1/2样品（可就地封存）必要时用于复检。抽样的蕞小销售包装不应有破裂，检验前不得启开。

在100级净化条件下用无菌方法打开用于检测的至少 3个包装，从每个包装中取样，准确称取10g±1g样品。剪碎后加人到200ml灭菌生理盐水中，充分混匀，得到一个生理盐水样液。液体产品用原液直接做样液。

如被检样品含有大量吸水树脂材料而导致不能吸出足够样液时，稀释液量可按每次 50ml递增，直至能吸出足够测试用样液。在计算细菌菌落总数与真菌菌落总数时相应调整稀释度。

B2  细菌菌落总数与初始污染菌检测方法

本方法适用于产品初始污染菌与细菌菌落总数（以下统称为细菌菌落总数）检测。

B2.1 操作步骤

待上述生理盐水样液自然沉降后取上清液作菌落计数。共接种 5个平皿，每个平皿中加人 1ml样液，然后用冷却至45℃左右的熔化的营养琼脂培养基 15～20ml倒人每个平皿内混合均匀 。待琼脂凝固后翻转平皿置 35℃±2℃培养 48h后，计算平板上的菌落数。

B2.2 结果报告

菌落呈片状生长的平板不宜采用；计数符合要求的平板上的菌落，按式（B1）计算结果：

X1=A×（K÷5）

式中X1—–细菌菌落总数 cfu/g或cfu/mL；

A——5块营养琼脂培养基平板上的细菌菌落总数；

K——稀释度。

当菌落数在 100以内，按实有数报告，大于 100时采用二位有效数字。

如果样品菌落总数超过本标准的规定，按 B2.3进行复检和结果报告。

B2.3 复检方法

将留存的复检样品依前法复测 2次，2次结果平均值都达到本标准的规定，则判定被检样品合格；其中有任何 1次结果平均值超过本标准规定，则判定被检样品不合格。

B3  大肠菌群检测方法

B3.1 操作步骤

取样液 5ml接种 50ml，乳糖胆盐发酵管，置 35℃±2℃培养 24h，如不产酸也不产气，则报告为大肠菌群阴性。

如产酸产气，则划线接种伊红美蓝琼脂平板，置35℃±2℃培养 18～24h，观察平板上菌落形态。典型的大肠菌落为黑紫色或红紫色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽，也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉红色，中心较深的菌落。

取疑似菌落 1-2个作革兰氏染色镜检，同时接种乳糖发醉管，置 35℃±2℃培养 24h，观察产气情况。

B3.2 结果报告

凡乳糖胆盐发酵骨产酸产气，乳糖发酵管产酸产气，在伊红美蓝平板上有典型大肠菌落，革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，可报告被检样品检出大肠杆菌。

B4  绿脓杆菌检测方法

B4.1 操作步骤

取样液 5ml，加人到50ml SCDLP培养液中，充分混匀，置 35℃±2℃培养 18～24h。如有绿脓杆菌生长，培养液农面呈现一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。从培养液的薄菌膜处挑取培养物，划线接种十六烷三甲基溴化胺琼脂平板，置 35℃±2℃ 培养 18～24h，观察菌落特征。绿脓杆菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其他菌不长。

取可疑菌落涂片作革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性菌者应进行下列试验：

氧化酶试验：取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻棒挑取可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的 1%二甲基对苯二胺试液，30s内出现粉红色或紫红色，为氧化酶试验阳性，不变色者为阴性。

绿脓菌素试验：取2-3个可疑菌落，分别接种在绿脓菌素测定用培养基斜面，35℃±2℃培养24h，加入 3～5ml，充分振荡使培养物中可能存在的绿脓菌素溶解，待三-氯-甲-烷呈蓝色时，用吸管移到另一试管中并加人 1mol/L的盐酸1mL，振荡后静置片刻。如上层出现粉红色或紫红色即为阳性，表示有绿脓菌素存在。

硝酸盐还原产气试验：挑取被检菌落纯培养物接种在硝酸盐脉水培养基中，置 35C12C培养24h培养基小倒管中有气者即为阳性

明胶液化试验:取可疑菌落纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置 35℃±2℃培养 24h，取出放于4～10C，如仍呈液态为阳性，凝固者为阴性。

42℃生长试验：取可疑培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，置 42℃培养 24～48h，有绿脓杆菌生长为阳性。

B4.2 结果报告

被检样品经增菌分离培养后，证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓杆菌试验均为阳性者，即可报告被检样品中检出绿脓杆菌 如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出绿脓杆菌。

B5 金黄色葡萄球菌检测方法

B5.1 操作步骤

取样液 5ml，加入到 50mL SCDLP培养液中，充分混匀，置 35℃±2℃培养 24h，自上述增菌液中取1～2接种环，划线接种在血琼脂培养基上，置 35℃±2℃培养24～48h。在血琼脂平板上该菌菌落呈金黄色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。

挑取典型菌落，涂片作革兰氏染色镜检，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列成葡萄状，无芽胞与荚膜。镜检符合 上述情况，应进行下列试验：

甘露醇发酵试验：取上述菌落接种甘露醇培养液，置 35℃±2℃培养 24h，发酵甘露醇产酸者为阳性。

血浆凝固酶试验：（1）玻片法：取清洁干燥载玻片，一端滴加一滴生理盐水，另一端滴加一滴兔血浆，挑:取菌落分别与生理盐水和血浆混合，5min如血浆内出现团块或颗粒状凝块，而盐水滴仍呈均匀混浊无凝固则为阳性，如两者均无凝固则为阴性。凡盐水滴与血浆滴均有凝固现象，再进行试管凝固酶试验；（2）试管法：吸取 1：4新鲜血浆 0.5ml，放灭菌小试管中，加入等量待检菌 24hrou汤培养物 0.55mL，混匀，放 35℃±2℃温箱或水浴中，每半小时观察一次，24h之内呈现凝块即为阳性。同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株汤培养物各0.5ml，作为阳性与阴性对照。

B5.2 结果报告

凡在琼脂平板上有可疑菌落生长，镜检为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌。

B6 溶血性链球菌检测方法

B6.1 操作步骤

取样液 5ml加人到 50ml葡萄糖ROU汤， 35℃±2℃培养 24h，将培养物划线接种血琼脂平板， 35℃±2℃培养24h观察菌落特征。溶血性链球菌在血平板上为灰自色，半透明或不透明，针尖状突起，表面光滑，边缘整齐，周围有无色透明溶血圈。

挑取典型菌落作涂片革兰氏染色镜检，应为革兰氏阳性，呈链状排列的球菌。镜检符合上述情况，应进行下列试验：

链激酶试验：吸取草酸钾血浆 0.2ml（0.01g草酸钾加5mL兔血浆混匀，经离心沉淀，吸取上清液），加人 0.8ml灭菌生理盐水，混匀后再加人待检菌 24h rou汤培养物0.5ml和0.25%氯化钙0.25ml，混匀，放 35℃±2℃水浴中，2min观察一次（一般10min内可凝固），待血浆凝固后继续观察并记录溶化时间。如 2h内不溶化，继续放置 24h观察，如凝块全部溶化为阳性，24h仍不溶化为阴性。

杆菌肤敏感试验：将被检菌菌液涂于血平板上，用灭菌镊子取每片含 0.04单位杆菌肤的纸片放在平板表面仁，同时以已知阳性菌株作对照，在 35℃±2℃下放置 18～24h，有抑菌带者为阳性。

B6.2 结果报告

镜检革兰氏阳性链状排列球菌，血平板上呈现溶血圈，链激酶和杆菌肤试验阳性，可报告被检样品检出溶血性链球菌。

B7 真菌菌落总数检测方法

B7.1 操作步骤

待上述生理盐水样液自然沉降后取上清液作真菌计数。共接种5个平皿，每个平皿中加人 1ml样液，然后用冷却至 45℃左右的熔化的沙氏琼脂培养基 15 ～25mL倒人每个平皿内混合均匀，琼脂凝固后翻转平皿置 25℃±2℃培养 7天，分别于 3，5，7天观察，计算平板上的菌落数，如果发现菌落蔓延，以前 一次的菌落计数为准。

B7.2 结果报告

菌落呈片状生长的平板不宜采用；计数符合要求的平板上的菌落，按式（B2）计算结果：

X2=B×（K÷5）

式中X2—–真菌菌落总数，cfu/g或cfu/mL；

B—–5块沙氏琼脂培养基平板上的真菌菌落总数;

K—–稀释度。

当菌落数在 100以内，按实有数报告，大于 100时采用二位有效数字。

如果样品菌落总数超过本标准的规定，按 B7.3进行复检和结果报告。

B7.3 复检方法

将留存的复检样品依前法复测 2次，2次结果都达到本标准的规定，则判定被检样品合格；其中有任何 1次结果超过本标准规定，则判定被检样品不合格。

B8 真菌定性检测方法

B8.1 操作步骤

取样液 5mL加入到50mL沙氏培养基中， 25℃±2℃培养 7天，逐日观察有无真菌生长。 

B8.2 结果报告

培养管混浊应转种沙氏琼脂培养基，证实有真菌生长，可报告被检样品检出真菌。